DB22_T 3646-2024 长白山林蛙油鉴别高效液相色谱蛋白质特征图谱法

ICS 71.040 CCS B 04 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 36462024 长白山林蛙油鉴别 高效液相色谱蛋白质特 征图谱法 Authentification of Changbai mountain Ranae Oviductus-high perance liquid chromotography HPLC based protein characteristic chromatogram 2024 - 07 - 25 发布 2024 - 09 - 01 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 36462024 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分标准化文件的结构和起草规则和 GB/T 20001.42015标准编写规则 第 4 部分试验方法标准的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件由吉林省农业农村厅负责组织实施。 本文件起草单位吉林农业大学、吉林大学、吉林省林蛙标准化技术委员会、吉林黄栀花药业有限 公司。 本文件主要起草人王诗涵、王志寒、王永生、王道君、伊常青。 I DB22/T 36462024 长白山林蛙油鉴别 高效液相色谱蛋白质特征图谱法 1 范围 本文件规定了林蛙油鉴别蛋白质组成的特征图谱法的分析原理、试剂及材料、试剂配制、仪器设备、 样品、试验步骤及实验数据分析的要求。 本文件适用于长白山林蛙油真实性的鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 长白山林蛙油 Changbai mountain Ranae Ovidutus 蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙的输卵管。主产于长白山地区， 由中华人民共和国药典（2020 版）一部收载的哈蟆油，经采制干燥而得。 4 原理 中药特征图谱可采用特征峰保留时间评价，供试品特征图谱的相关色谱峰应与相应的参照物色谱 峰保留时间相同。特征峰相对保留时间规定值范围一般应不超过10。实验以溶菌酶作参照物，通过 分析林蛙油蛋白质特征峰与参照峰的相对保留时间确定目标峰，根据指纹图谱软件提取长白山林蛙油 中蛋白质组成成分的特征峰，建立蛋白质对照特征图谱，进行真实性鉴别。 5 试剂和材料 警示使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 除特别说明外，所有试剂均为分析纯。 5. 1 石油醚沸点范围 60 ℃90 ℃。 5.2 乙腈（C2H3N）色谱纯。 5.3 二硫苏糖醇（C4H10O2S2，DTT）。 5. 4 三氟乙酸（C2HF3O2 ，TFA）。 5.5 溶菌酶纯度＞98。 5.6 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）。 1 DB22/T 36462024 5. 7 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） 5.8 硫酸铵（ NH42SO4）。 5.9 盐酸胍（CH5N3.HCl）。 5. 10 水（H2O）GB/T 6682 规定的一级水。 6 试剂配制 6. 1 磷酸盐缓冲液（PBS）（0.1 mol/L pH 7.4）使用天平称取 6.04 g 二水合磷酸二氢钠和 8.71 g 的无水磷酸氢二钠，混合后用水定容至 1 L。 6. 2 60 饱和度的硫酸铵溶液在 25 ℃ 下，使用天平称取 390 g 硫酸铵，加水至 1 L 后搅拌溶 解即获得 60 饱和度的硫酸铵溶液。 6. 3 盐酸胍（1 mL 6 mol/L）含 DTT（10 mmol/L）使用天平称取 57.3 g 盐酸胍和 0.1542 g DTT 混合，加入水溶解定容至 100 mL。 7 仪器设备 7. 1 高效液相色谱仪-紫外检测器。 7. 2 冷冻离心机0 rpm～12000 rpm，0 ℃4 ℃。 7. 3 电热鼓风干燥箱。 7,4 旋转蒸发仪。 7.5 粉碎机频率50 Hz～60 Hz。 7.6 磁力搅拌器。 7.7 天平感量0.001 g 和 0.00001 g。 7.8 300 C8 色谱柱250 mm4.6 mm，5 μm。 7.9 二号筛。 7.10 具塞锥形瓶100 mL。 7.11 离心管100 mL。 7.12 布氏漏斗100 mL。 7.13 抽滤瓶250 mL。 7. 14 透析袋截留分子量8000 Da。 7.15 容量瓶1 mL 和 5 mL。 7.16 微孔滤膜0.45 μm。 7. 17 样品瓶1.5 mL。 8 样品 应符合中华人民共和国药典（2020 年版）一部中哈蟆油项下性状、鉴别和检查的相关要求。 9 试验步骤 9. 1 试样制备 2 DB22/T 36462024 取 10 g 1 g 的林蛙油样品混匀后，经粉碎机粉碎后过二号筛，取上述粉碎后样品 2 g，称定， 置于具塞锥形瓶中经 20 mL石油醚室温搅拌脱脂 1 h，用布氏漏斗和抽滤瓶滤过后，粉末置于电热鼓 风干燥箱中 55 ℃ 烘干 1 h，保存备用。 9.2 供试品溶液制备 9.2.1 取试样 0.5 g，称定，置于具塞锥形瓶中，加磷酸盐缓冲液 50 mL。 9.2.2 磁力搅拌器连续 25 ℃ 搅拌 8 h 后，以 5000 r/min 离心 15 min，收集上清液，再次提取沉 淀物，合并全部上清液。 9.2.3 向上清液中（9.2.2）加入 1.5 倍含 0.085 三氟乙酸（v/v）的乙腈放置 1 h 后，以 5000 r/min 离心 15 min，收集全部上清液。 9.2.4 上清液（9.2.3）在 50 ℃ 下使用旋转蒸发仪回收乙腈，得到浓缩液 0.5 mL～1.5 mL。 9.2.5