抗血管内皮生长因子抗体对肝癌的放射增敏作用

抗血管内皮生长因子抗体对肝癌的放射增敏作用 【摘要】 目的 观察抗血管内皮生长因子抗体VEGF mAb与不同剂量放射联合对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用. 方法 将SMMC7721肝癌细胞种植于裸鼠皮下,成瘤动物分为单纯放射20 Gy组、放射20 Gy抗体组、放射30 Gy抗体组和对照组,腹腔给予抗VEGF mAb 50 μg/只，隔日1次,共6次,放射剂量一次性给予.测量肿瘤直径并计算瘤体积,抗体给药结束后2 wk处死动物,免疫组化法测肿瘤微血管密度MVD. 结果 放射能抑制肿瘤生长,减少肿瘤MVD,放射与抗体结合对肿瘤生长的抑制作用更显着，且放射30 Gy抗体比放射20 Gy抗体效果更好.单纯放射20 Gy组、放射20 Gy抗体组和放射30 Gy抗体组的瘤质量抑制率分别为,和,差异有统计学意义. 结论 抗VEGF mAb对放射治疗肝癌移植瘤有增敏作用,是肝癌综合治疗的有效途径之一. 【关键词】 肝肿瘤;放射疗法;抗VEGF单抗;放射增敏 0引言 放射治疗肿瘤的目的是尽可能提高肿瘤的放射剂量以杀灭瘤细胞,但同时正常组织和器官所受辐射量也相应提高,增加了放射治疗的副反应,因而限制了通过提高放射剂量来控制肿瘤的作用.肝癌是放射欠敏感肿瘤,而正常肝组织对放射线较敏感.单纯放射治疗肝癌的疗效并不理想［1］.有报道［2］抗血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor, VEGF抗体可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生长,我们观察抗VEGF mAb与不同放射剂量联合对肝癌移植瘤生长的抑制作用,以了解两者联合应用的机制与方法. 1材料和方法1材料Balb/cnu/nu小鼠20只南方医科大学实验动物中心,5～6 wk龄,雄性,体质量～ g, SPF层流柜分笼饲养; SMMC7721人肝癌细胞株; Monoclonal antiVEGF antibody, produced in mouse, clone ;培养箱,倒置显微镜XDP1,上海光学仪器厂,Varian 23EX医用直线加速器,RPMI1640细胞培养液,胰蛋白酶,免疫组化SABC法相关试剂.2方法癌细胞培养SMMC7721人肝癌细胞株于25 mL培养瓶中繁殖传代,细胞贴壁长满瓶壁后移入250 mL培养瓶继续传代繁殖,取指数生长期细胞胰酶消化,2000 r/min离心2 min,收集细胞用生理盐水悬浮,显微镜下以细胞计数板计算细胞密度,生理盐水定容细胞密度为21010/L.癌细胞种植参考文献［3］方法,裸鼠于饲养环境适应1 d后种植癌细胞,取裸鼠右后肢大腿外侧皮下为种植点,1 mL注射器抽取 mL细胞悬液注入种植点皮下.动物分组及肿瘤生长观察肿瘤种植后1 wk, 可观察到全部动物有明显皮下肿块形成,第10日肿块直径约5 mm.将动物随机分为4组,即单纯放射20 Gy组、放射20 Gy抗体组、放射30 Gy抗体组和对照组,每组5只.用游标卡尺测量肿块长径及横径,隔日测量1次,肿瘤体积Vab2/2.抗体给予及放射治疗以 μm针式滤器过滤除菌的PBS液溶解抗VEGF mAb至100 mg/L,于肿瘤种植后10 d分组后腹腔注射抗VEGF mAb, 50 μg/只,隔日1次,共6次.单纯放射组及对照组同样途径给予等体积量PBS.第4次给予抗VEGF mAb后的第2日行放射治疗,放疗机房紫外线消毒,受照动物四肢以细绳固定在小木板上,照射野大小3 cm3 cm,源皮距100 cm,6 MeV电子线,剂量率4 Gy/min,单纯放射组剂量20 Gy,放射抗体组剂量分别为20 Gy和30 Gy,全部放射剂量一次性给予.瘤体称质量抗体给药结束后继续观察肿瘤生长2 wk,于肿瘤种植后34 d处死动物,仔细分离肿块周边皮肤及非肿瘤组织,瘤体称质量,瘤质量抑制率100.免疫组化微血管密度MVD测定将肿瘤组织切成3 mm厚片状,40 g/L甲醛固定24 h,脱水石蜡包埋,切片厚5 μm.免疫组化SABC法一抗为多克隆兔抗鼠CD34抗体,工作浓度1∶100稀释.即用型HighSABC免疫组化试剂盒,具体操作按试剂盒说明进行,DAB染色,苏木素复染,树胶封片.选血管内皮细胞染色密集区于高倍镜200下计数染色细胞,每片计数5个视野取平均值. 统计学处理 SPSS 统计分析软件,应用重复测量数据方差分析处理肿瘤体积变化数据,多个独立样本非参数检验处理瘤质量抑制数据和MVD数据,为差异有统计学意义. 2结果 放射和抗VEGF mAb对肿瘤生长的抑制作用SMMC7721人肝癌细胞培养时增殖及传代能力强,裸鼠皮下种植成瘤率高,20只动物全部成瘤.种瘤后10 d动物分组时各组肿瘤体积无显着性差异,放射治疗前给予抗体4次,肿瘤生长呈现减慢趋势,但与非抗体组差异不显着.放射治疗后,单纯放射组及放射20 Gy抗体组肿瘤仍缓慢生长,但放射30 Gy抗体组肿瘤生长完全被抑制,肿瘤缩小.种瘤后20 d单纯放射组、放射20 Gy 抗体组和放射30 Gy抗体组肿瘤体积显着小于对照组,且放射与抗体联合组优于单纯放射组,此显着性差异一直持续至动物处死种瘤后34 d,放射30 Gy抗体组肿瘤体积小于放射20 Gy 抗体组. 表1放射和抗VEGF mAb对肿瘤生长的抑制作用略 bP＜ vs对照组;cP＜ vs单纯放射组;eP＜ vs放射20 Gy抗体组. 瘤质量抑制率和MVD单纯放射组、放射20 Gy抗体组和放射30 Gy 抗体组在动物处死时的瘤质量抑制率分别为,和 ,均有明显抑制肿瘤质量增长作用.放射30 Gy抗体组瘤质量明显低于单纯放射组和放射20 Gy抗体组.各处理组MVD低于对照组,放射与抗体联合较单纯放射组MVD低,MVD在放射20 Gy抗体组与放射30 Gy抗体组之间差异无统计学意义表2. 表2瘤质量抑制率与微血管密度略 bP＜ vs对照组;cP＜ vs单纯放射组;eP＜ vs放射20 Gy抗体组. 3讨论 SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤细胞的形态和结构与人肝癌细胞特性类似［3］,移植瘤生长迅速,未经治疗的肿瘤生长速度快,单纯放射治疗能延缓其生长速度,联合抗VEGF mAb后抑制肿瘤生长效果更明显,但单纯放射或放射20 Gy加抗体组肿瘤仍呈逐渐加速的生长趋势.虽然放射和抗VEGF mAb均能抑制肝癌移植瘤生长,但实验结果显示放射30 Gy加抗体是较好的联用方式,瘤体生长停滞并有缩小,对瘤质量和瘤体积的抑制都优于低剂量放射组. 放射是以肿瘤细胞为靶点的治疗措施,通过对肿瘤细胞的杀灭来控制其生长.放射在杀灭瘤细胞的同时又诱导肿瘤细胞表达VEGF升高,保护血管内皮细胞抗拒放射线攻击,促进肿瘤血管形成［4］;或通过提高肿瘤细胞基质分解酶活性,增强瘤细胞的侵袭力［5］,因而放射诱导了肿瘤的保护机制,降低瘤细胞对放射线的敏感性.抗VEGF mAb抑制VEGF的表达和血管形成,使肿瘤赖以生长及转移的血管形成不足,本身具有抗肿瘤作用;又能通过降低VEG