含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡的影响

含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡的影响 含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、 增殖及凋亡的影响 [摘要] 目 的 视察含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、 增殖及凋亡的影响， 并与 316L 不锈钢进行比较。 方法 将血管内皮细胞接种于两种材料表面， 在培育 1、 2、 3 d 后， 应用吖啶橙染色及甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞在两种材料表面黏附和增殖活性。 并制备两种材料的浸提液，用浸提液培育血管内皮细胞， 采纳流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 荧光显微镜下， 细胞在两种材料表面均伸展良好， 呈铺路石状生长。 在培育1、 2 d 时， 含铜不锈钢组黏附的细胞数多于 316L 不锈钢组（P0. 05）。 MTT结果显示， 含铜不锈钢组在 1、 2 d 的吸光度值高于 316L 不锈钢组， 差异有统计学意义（P0. 05）； 而在培育 3 d 后， 两组间差异无统计学意 义（P0. 05）。 316L 不锈钢组的早期凋亡率高于含铜不锈钢组， 差异有统计学意义（P0. 05）。 结论 含铜不锈钢较 316L 不锈钢更利于血管内皮细胞的黏附及增殖， 并可以降低血管内皮细胞的早期凋亡率。 [关键词] 含铜不锈钢； 血管内皮细胞； 黏附； 增殖； 细胞凋亡 [ 中 图 分 类 号 ] R 783. 5 [ 文 献 标 识 码 ] A [doi] 10. 7518/hxkq. 2013. 01. 005 在正畸治疗中， 支抗限制贯穿于整个治疗过程， 是治疗成败的重要因素之一[1] 。 微种植体的支抗作用 是通过种植钉与骨界面的组织学机械锁结和骨结合， 从而反抗肯定限度内的矫治力[2]。 在种植体愈合过程 中， 新生血管的形成早于成骨活动的起先[3] 。 血管内皮细胞合成和分泌的调整因子具有调控成骨细胞趋化、 增殖及分化的功能[4] 。 而细胞的生物学行为受生物材料自身性能的影响[5] 。 因此， 不同种植材料很可能会影响种植体-骨界面血管内皮细胞的生物学性状。 中国科学院金属探讨所研发的含铜不锈钢具有良好的抗菌性能和生物相容性， 能有效预防种植体四周细菌感染的发生[6-7] 。 本试验旨在视察含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、 增殖及凋亡状况的影响。 1 材料和方法 1. 1 材料 1. 1. 1 细胞株 人脐静脉内皮细胞株 EA. hy926 由中国医科高校中心试验室供应。 1. 1. 2 试验材料 316L 不锈钢为医用级不锈钢， 成分 Cr18， Ni12，其余为 Fe。 含铜不锈钢（316L- Cu）， 成分 Cr18， Ni12， Cu4， 其余为 Fe， 材料由中国科学院金属探讨所供应。 1. 1. 3 主要试剂和设备 DMEM、 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）、 二甲基亚砜（di-methylsulfoxide， DMSO）、 胰蛋白酶（Sigma 公司， 美国）， 胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）， 吖啶橙 （上海化学试剂公司）， Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）， 荧光倒置显微镜（Nikon 公司， 日本）， 流式细胞仪（BD 公司， 美国）， 自动酶标检测仪（Tecan 公司， 奥地利）。 1. 2 方法 1. 2. 1 试件的制备 将含铜不锈钢和 316L 不锈钢制备成两种规格试件。 一种为直径 10 mm、 厚 2 mm， 各 15 片， 用于黏附试验和增殖活性检测； 另一种为直径 25 mm、 厚 2 mm， 各 5 片， 用于制备浸提液。 上述材料经超声清洗、 干燥， 高温高压（33 MPa、 121 ℃） 灭 菌处理后备用。 1. 2. 2 浸提液的制备 将直径 25 mm、 厚 2 mm 的两种不锈钢材料置于6 孔培育板中， 按试件表面积与培育液之比为 3 cm2 mL-1 加入 DMEM 培育液， 置于 37 ℃培育箱内， 浸泡 72 h 后收集浸提液。 1. 2. 3 黏附和增殖活性检测 将直径 10 mm、 厚 2 mm 的两种不锈钢试件置于无菌 24 孔板中。 用 0. 25胰蛋白酶消化处于对数生长期的血管内皮细胞， 制备成密度为每毫升 2104 个的细胞悬液， 接种到各材料表面，静置 3 h 后， 从各孔板侧壁缓慢加入 DMEM 培育基 1 mL。 标准条件下分别培育 1、 2、 3 d 后， 将两种材料各取出 2 片， PBS 冲洗 3 次， 95乙醇固定10 min， 晾干， 加入 0. 1 mg mL-1 吖啶橙染液， 0. 1 mol L-1 氯化钙分色。 在荧光显微镜下视察细胞在不同材料表面的黏附状况， 随机选取上、下、 左、 右、 中 5 个视野拍照并计数。 用 MTT 法检测两种材料表面血管内皮细胞的增殖活性。 在培育 1、 2、 3 d 后， 分别取出两种不锈钢材料各 3片， PBS 冲洗后， 置于一预先加入 DMEM 培育液的新 24 孔板内。 每孔加入5 mg mL-1 的 MTT 试剂 80 L， 接着培育 4 h 后， 弃培育基， 每孔加入450 L DMSO， 37 ℃下静置 2 h， 待蓝紫色结晶物彻底溶解后， 振荡 10 min。 将每孔中的液体按每孔 150 L 吸入 96 孔板中， 用酶标仪读取吸光度值 （A 值）（波长 490 nm）， 试验重复 3 次。 1. 2. 4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将浓度为每毫升 2105 个的血管内皮细胞接种于 3 块 6 孔板中， 分别设计为含铜不锈钢组、 316L 不锈钢组和比照组。 培育 24 h 后， 用浸提液置换孔板中的培育液， 比照组用新培育液置换， 接着培育 24 h。 用 0. 25胰酶消化细胞， 1 000 r min-1 下离心后重悬， 制成单细胞悬液， 分别加入 Annexin V-FITC 和 PI， 避光反应15 min， 用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。 1. 3 统计学方法 采纳 SPSS 17. 0 统计软件对试验数据进行分析， 数据以 xs 表示，对黏附在材料表面的细胞数及增殖活性采纳 t 检验进行分析， 对细胞凋亡率采纳方差分析， P0. 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2. 1 荧光显微镜视察结果 荧光显微镜下， 细胞呈多角形， 铺路石样排列（图 1）。 在培育 1、 2 d 后， 含铜不锈钢组材料表面黏附的内皮细胞数明