含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达.doc

含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达.doc 含 SARS CoV RNA 病毒样颗粒的构建和表达 作者 李振勇， 景建洲， 刘明霞， 邵大晓， 冯艳铭， 李智涛， 宋国英， 王秋旗， 王云龙， 屈凌波， 赵玉芬 【关键词】 病毒样颗粒 【 Abstract 】 AIM To construct and express RNaseresistant viruslike particles containing the RNA fragments of SARS CoV. S The primers of MS2 assembly protein gene, coat protein gene and the fragment of SARS Cov RNA polymerase gene were synthesized according to their sequences from Genbank data and were used to amplify their cDNAs by RTPCR. These cDNAs were purified with SABCs ResincolumTM system for DNA purification from agarose gel. Expression vector pTrc99a and their cDNA fragments were ligated together with T4 DNA ligase after digestion with restriction enzymes. The prokaryotic expression was obtained by the transation of the recombinant plasmid constructed above into E. coli JM109. The obtained viruslike particles were purified and tested by quantitative analysis, RTPCR and stable experiment. RESULTS The RNaseresistant viruslike particles containing the RNA fragments of SARS CoV was successfully constructed and remained stable for 30 days at 37℃. CONCLUSION The newtype viruslike particles can be conveniently used as positive control of SARS clinical nucleic diagnostic reagents. 【 Keywords 】 SARS; reverse transcriptase polymerase chain reaction; RNA, viruslike particles; ribonucleases 【摘要】 目的 构建并表达含有 SARS 冠状病毒 RNA 片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒. 方法 通过克隆大肠杆菌噬菌体 MS2 的装配蛋白和壳蛋白基因以及 SARS 冠状病毒 RNA 聚合酶基因片段， 将这些基因连接到载体 pTrc99a 上表达， 并进行纯化、 定量分析、 RTPCR 检测和稳定性试验. 结果 获得病毒样核蛋白颗粒， 在 37℃稳定性可达到 30 d， 能反抗核糖核酸酶降解. 结论 该病毒样核蛋白颗粒稳定、 平安、 牢靠， 可作为 SARS 冠状病毒 RTPCR 检测、 定量分析的有效阳性参考品. 【关键词】 SARS； 逆转录聚合酶链反应； RNA， 病毒样颗粒； 核糖核酸酶类 0 引言 200211/200306 SARS［1, 2］ 在全球流行， 对全球尤其我国的经济发展带来了 巨大影响， 但在科技人员的努力下， 很快研制胜利了 快速、 精确的 SARS 病毒基因检测试剂. 临床检测中人们普遍关切的是检测试剂盒中运用的阳性参考品是否具有传染性、 或者能否起到阳性全程参比的作用. 因此， 研制稳定、无传染性的阳性参考品尤为重要. 我们依据 Drosten amp; Collahan 等［3, 4］ 报道的方法， 制备了 含有 SARS 冠状病毒 RNA 聚合酶基因片段的抗核糖核酸酶病毒样核蛋白 颗粒. 该病毒样颗粒能有效反抗 RNase 引起的 RNA 降解， 能作为 SARS 冠状病毒基因检测的阳性参考品， 对SARS 基因检测起到有效的全程监控作用. 1 材料和方法 1. 1 材料 ① 灭活的 SARS 冠状病毒样本由 Robert Koch Institut（德国） 供应，MS2 噬菌体（ATCC 15597B1） 购于美国 ATCC; ② 试剂 MLV 反转录酶（Promega） , dNTP Pharmacia , Taq DNA 聚合酶（华美生物工程公司） ,引物和荧光探针（上海生工公司合成） , 其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂; ③ RNA 提取试剂由华美生物工程公司供应; ④ SARS 荧光 PCR 定量检测试剂盒由华美生物工程公司 供应. 扩增仪器用美国 PE 公司 的PE7700 荧光扩增仪. 1. 2 方法 1. 2. 1 基因合成依据 Genbank 数据库中的基因序列， 设计合成大肠杆菌 噬 菌 体 MS2装 配 蛋 白 和 壳 蛋 白 基 因 引 物 MSUP （ 5 atgaattctcctgctcaacttcctgtcg3）与MSDOWN（5gcaagcttgttagtagatgccggagttt3 ）； SARS 冠状病毒 RNA 聚合酶基因引物SARSUP（5 tcaagcttcgcaagtattaagtgagatggtc3 ） 与 SARSDOWN（5tcaagcttaagcagttgtagcatcaccg3 ） . 用异硫氰酸胍方法提取靶 RNA， 悬浮在反转录反应液中， 其中含有 100 U 的 MLV 反转录酶、 50 U RNA 酶抑制剂、 1 反转录缓冲液、 N6 随机引物， 37℃孵育 60 min. PCR 反应体系中含有 20 pmol 引物、 1. 5 mmol/L MgCl2, 200 mol/L dNTP 和 3 U Taq DNA 聚合酶， 10 L 反转录产物， 反应参数是 94℃预变性 5 min, 然后 94℃ 1 min， 55℃ 1 min， 72