含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达_0

含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达 含 SARSCoVRNA 病毒样颗粒的构建和表达 作者 李振勇， 景建洲， 刘明霞， 邵大晓， 冯艳铭， 李智涛， 宋国英， 王秋旗， 王云龙， 屈凌波， 赵玉芬 【关键词】 病毒样颗粒 【Abstract】AIM ToconstructandexpressRNaseresistantviruslikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoV. STheprimersofMS2assemblyproteingene, coatproteingeneandthefragmentofSARSCovRNApolymerasegeneweresynthesizedaccordingtotheirsequencesfromGenbankdataandwereusedtoamplifytheircDNAsbyRTPCR. ThesecDNAswerepurifiedwithSABCsResincolumTMsystemforDNApurificationfromagarosegel. ExpressionvectorpTrc99aandtheircDNAfragmentswereligatedtogetherwithT4DNAligaseafterdigestionwithrestrictionenzymes.TheprokaryoticexpressionwasobtainedbythetransationoftherecombinantplasmidconstructedaboveintoE. coliJM109. Theobtainedviruslikeparticleswerepurifiedandtestedbyquantitativeanalysis, RTPCRandstableexperiment. RESULTS TheRNaseresistantviruslikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoVwassuccessfullyconstructedandremainedstablefor30daysat37℃. CONCLUSIONThenewtypeviruslikeparticlescanbeconvenientlyusedaspositivecontrolofSARSclinicalnucleicdiagnosticreagents. 【Keywords】SARS; reversetranscriptasepolymerasechainreaction; RNA, viruslikeparticles; ribonucleases 【摘要】 目的 构建并表达含有 SARS 冠状病毒 RNA 片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒. 方法 通过克隆大肠杆菌噬菌体 MS2 的装配蛋白和壳蛋白基因以及 SARS 冠状病毒 RNA 聚合酶基因片段， 将这些基因连接到载体 pTrc99a 上表达， 并进行纯化、 定量分析、 RTPCR 检测和稳定性试验. 结果 获得病毒样核蛋白颗粒， 在 37℃稳定性可达到 30d，能反抗核糖核酸酶降解. 结论 该病毒样核蛋白颗粒稳定、 平安、 牢靠，可作为 SARS 冠状病毒 RTPCR 检测、 定量分析的有效阳性参考品. 【关键词】 SARS； 逆转录聚合酶链反应； RNA， 病毒样颗粒； 核糖核酸酶类 0 引言 200211/200306SARS［1, 2］ 在全球流行， 对全球尤其我国的经济发展带来了巨大影响， 但在科技人员的努力下， 很快研制胜利了快速、精确的 SARS 病毒基因检测试剂. 临床检测中人们普遍关切的是检测试剂盒中运用的阳性参考品是否具有传染性、 或者能否起到阳性全程参比的作用. 因此， 研制稳定、 无传染性的阳性参考品尤为重要. 我们依据 Drostenamp; Collahan 等［3, 4］ 报道的方法， 制备了含有 SARS冠状病毒 RNA 聚合酶基因片段的抗核糖核酸酶病毒样核蛋白颗粒. 该病毒样颗粒能有效反抗 RNase 引起的 RNA 降解， 能作为 SARS 冠状病毒基因检测的阳性参考品， 对 SARS 基因检测起到有效的全程监控作用. 1 材料和方法 1. 1 材料 ①灭活的 SARS 冠状病毒样本由 RobertKochInstitut（德国） 供应， MS2 噬菌体（ATCC15597B1） 购于美国 ATCC; ②试剂 MLV 反转录酶 （Promega）, dNTPPharmacia , TaqDNA 聚合酶 （华美生物工程公司）,引物和荧光探针 （上海生工公司合成） , 其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂; ③RNA 提取试剂由华美生物工程公司供应; ④SARS 荧光PCR 定量检测试剂盒由华美生物工程公司供应. 扩增仪器用美国 PE 公司的 PE7700 荧光扩增仪. 1. 2 方法 1. 2. 1 基因合成依据 Genbank 数据库中的基因序列， 设计合成大肠 杆 菌 噬 菌 体 MS2 装 配 蛋 白 和 壳 蛋 白 基 因 引 物 MSUP （ 5 atgaattctcctgctcaacttcctgtcg3）与MSDOWN（5gcaagcttgttagtagatgccggagttt3 ）； SARS 冠状病毒 RNA 聚合酶基因引物 SARSUP （5 tcaagcttcgcaagtattaagtgagatggtc3 ）与 SARSDOWN（5 tcaagcttaagcagttgtagcatcaccg3 ）. 用异硫氰酸胍方法提取靶RNA， 悬浮在反转录反应液中， 其中含有 100U 的 MLV 反转录酶、 50URNA酶抑制剂、 1反转录缓冲液、 N6 随机引物， 37℃孵育 60min. PCR 反应体系中含有 20pmol 引 物、 1. 5mmol/LMgCl2, 200 mol/LdNTP 和3UTaqDNA 聚合酶， 10 L 反转录产物， 反应参数是 94℃预变性 5min,然后 94℃1min， 55℃1min， 72℃3min, 进行 35 个循环， 最终在 72℃延长 5min［5］ . 1. 2. 2cDNA 纯化用 PCR 产物纯化试剂盒， 并将 cDNA 悬浮在 TE 缓冲液中备用. 1. 2. 3cDNA 片段克隆表达将表达载体 pTrc99a （Pharmacia）和 MS2的 cDNA 片段用 EcoRⅠ /HindⅢ双酶切， SARS 的 cDNA 片段用 HindⅢ单酶切. 消化反应体系中含有 10U 的 EcoRⅠ , 10U 的 HindⅢ, 1内切酶缓冲液， 37℃孵育 60min. 连接反应体系包括 1U 的 T4DNA 连接酶、 基因片段、 1连接缓冲液， 12℃孵育 2h. 依据 CaCl2 方法将重组质粒转化到 E. coliJM109 中，