合肥工业大学---生化综合实验报告

生物化学综合试验 黄豆芽总DNA的提取及亲缘关系的探讨 姓名逯玉东 学号 20106441 班级生物学院食品10-2班 试验时间 2012.7.22012.7.3 试验目的 1、 学会和驾驭核酸制备的一些基本操作和方法，并通过分光光度法和电泳等试验技术探讨核酸的性质； 2、 学习用紫外分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、浓度的原理与方法。 3、 驾驭利用限制性内切酶酶切DNA的原理和方法,培育学生利用限制性内切酶位点图谱进行试验设计的实力； 4、 学会通过琼脂糖凝胶电泳法分析不同材料之间DNA的亲缘关系。 关键词 核酸制备，CTAB法，限制性内切酶，分光光度法，电泳 Abstract 1. The extraction of plant DNA. 2. Determination of plant DNA purity and concentration. 3. Plant DNA restriction endonuclease enzymatic. 4. DNA agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments. 5. Studies on the relationships of plant DNA. Key words Nucleic acid preparation, CTAB, Restriction endonuclease, Spectrophotometry, Electrophoesis. 一． 黄豆芽DNA的提取 1. 材料正在生长的黄豆芽 2.主要仪器和用具 高速冷冻离心机（16 000 r/min）; 恒温水溶； 紫外可见光分光光度计； 电泳仪及微型电泳槽； 电冰箱； 凝胶成像系统或手提式紫外检测仪； 微波炉； 电子天平； 纯水系统； 1.5 mL离心管及离心架； 微量移液管10 uL、200uL、1 000uL各1支及各量程吸头； 常用玻璃仪器及滴管等； 一次性塑料手套。 3. 试剂 （1）0.1 mol/LTris-HCl pH8.0缓冲液（0.607gTris碱溶于40ml灭菌双蒸水。用浓盐酸（2.1ml）调整至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌）； （2）CTAB提取缓冲液100 mM Tris-HClpH8.0 （0.607gTris碱溶于40ml灭菌双蒸水。用浓盐酸（2.1ml）调整至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌），20 mmol/L EDTA（0.3722gEDTA溶于40ml灭菌双蒸水。用NaOH调整至PH至8.0，定容至50ml，高压灭菌）,1.4 M/L NaCl称取4.095gNacl于烧杯中，加10ml水溶解，再定容至50ml，2CTAB运用前加入0.22体积的β-巯基乙醇（2gCTAB，8.18gNaCl,0.74gEDTA,加入10ml1mol/L的Tris-Hcl（PH8），0.2ml巯基乙醇，加水定容到100ml）； （3）Tris-HCl溶液饱和酚/氯仿/异戊醇（25241，V/V/V）； （4）RNA酶A（DNase-free RNase A）； （5）70乙醇； （6）预冷无水乙醇； （7）pH8.0 TE缓冲液或ddH2O10 mmol/L Tris-HCl（0.607gTris碱溶于400ml灭菌双蒸水。用浓盐酸（21ml）调整至PH至8.0，定容至500ml，高压灭菌）,1 mmol/L EDTA,PH8.0（0.1816gEDTA溶于400ml灭菌双蒸水。用NaOH调整至PH至8.0，定容至500ml，高压灭菌）; （8）琼脂糖； （9）5X TBE缓冲液称取54．0gTris，27．5g硼酸，加入20ml 500mmol/l的EDTA，先加800ml重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至1000ml。； （10）6X 上样缓冲液（在 50ml水中溶解0.25g溴酚蓝，加甘油30ml，加水定容至100ml。）； （11）1溴化乙锭（EB）染色液（将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或者电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存）。 4、试验步骤 （1）打算干净研钵（中、小号）、研杵、药匙、无水乙醇、异丙醇，预先放进冰箱预冷，以削减液氮用量。 （2）取用黄豆芽两片子叶之间生长旺盛的芽尖，先后用自来水、蒸馏水冲洗，用滤纸吸干水分，放进冰箱4摄氏度保存备用。 （3）称取0.10.5g 芽尖，在液氮中研磨，目的是裂开植物细胞，释放其中内含物，低温可抑制核酸酶的活性。待液氮蒸发完后，快速转入装有700 uL 预热过的（6065摄氏度）的CTBA 提取液的1.5mL 离心管中，轻轻混匀。 （4）6065摄氏度水浴3060min ，每10min轻轻摇动混匀。 （5）加等体积的氯仿/异戊醇（241， V/V），温柔摇动，使成乳状液。 （6）室温下（温度不低于15摄氏度），8000/min 离心15min，取上清液。依据须要，上清液可用氯仿/异戊醇反复抽提多次。 （7）用大孔吸头当心抽提上清液逐滴加入预冷的2/3体积的无水乙醇（或等体积的异丙醇），20摄氏度条件下放置30min 以上，5 000 r/min 低速离心 10 min4摄氏度，收集沉淀。假如不见沉淀，将溶液放入20摄氏度 30min 至过夜，再离心，或用更高速度10 00012 000 r/min 离心10min 4摄氏度,收集沉淀。 （9）将收集到的沉淀移入另一新离心管中，加入12mL 70 乙醇冲洗液，轻摇几分钟，4摄氏度下10 000r/min 离心 5min ,收集沉淀。重复12次。 （10）打打开管盖，放干净场所晾干。 5、留意事项 （1）运用的研钵最好预先冷处理，勿使研钵的植物样品溶化。 （2）抽提过程温度不宜低于15摄氏度，以免CTAB沉淀而损失DNA。 （3）用氯仿/异戊醇抽提时，摇摆肯定要轻，否则简单使DNA 断裂，运用的吸头最好要口径大的或剪掉吸头尖。此外，应避开重复冻融步骤。 （4）提取的DNA不宜过分干燥，当乳白色的DNA沉淀变成透亮胶状即可。 二、 植物DNA纯度、浓度的测定 1、 材料提取的DNA溶液 2、主要仪器及用具 紫外分光光度计； 微波炉或电炉； 稳压电泳仪及水平式电泳槽； 凝胶成像系统或手提式紫外检测仪； 电冰箱； 电子天平； 微量移液器 10uL、200uL、1 000uL各1支吸头； 三角瓶； 离心管； 常用玻璃仪器及滴管等； 石蜡膜； 一次性塑料手套。 3.试验步骤 （一） 紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度 （1） 预热紫外分光光度计1020min。 （2） 取1支石英比色杯，装入TE溶液，作为空白，用于校正分光光度计。（DNA纯度及浓度测定） （3） 取5uL DNA待测样品加入另1支比色皿中，加TE溶液定容至3mL,用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。 （4） 将2