IMP

IMP 【摘要】 目的采用RT-PCR法获取TIMP-4基因，并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法从SD大鼠心肌组织中提取总RNA，利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因，经基因序列分析后构建表达载体PET-28a-TIMP-4，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2-NTA纯化和复性后，根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因，能在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的，N2-NTA纯化和复性后，纯度达90以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显着抑制。结论通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。 【关键词】 TIMP-4基因 克隆 基因表达 免疫活性 Abstract ObjectiveTo extract the gene of TIMP-4 with RT-PCR s and obtain the bioactive rat TIMP-4 fusion protein expressed in E. Coli. s Total RNA was extracted from cardiac muscle of SD rat. TIMP-4 gene was obtained and amplified with RT-PCR . The isolated fragment was sequenced, recombined with plasmid pET-28a at EcoRI and HindⅢ sites and transed into cells. The expression of TIMP-4 was induced by IPTG. TIMP-4 protein was purified and renaturalized by N2-NTA. The capability of inhibiting migration of osteosarcoma cell line was used as a measure to assay its viability. Results The TIMP-4 gene of the rat, which was cloned and correctly coded, could be highly expressed in the strain. The expressed product of the TIMP-4 amounted for of the total bacterial protein. The TIMP-4 amounted for at least 90 after N2-NTA purification. The purified TIMP-4 protein could significantly inhibit the migration of osteosarcoma cell line. Conclusion TIMP-4 fusion protein with bioactivity can be obtained profusely by gene cloning and expression in E. Coli. Key words TIMP-4; gene clone; expression; viability assay 目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施，其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性，对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质结构的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶为一类蛋白水解酶家族，它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质结构，为肿瘤的生长、转移创造合适的环境。金属蛋白酶组织抑制剂的发现是肿瘤研究上的一大突破，它是MMP的天然抑制剂，目前根据发现的时间顺序分别称为TIMP。国内外对于TIMP-4的功能已经有了一些研究，但结果有所差异。Jiang等[1]的研究发现，TIMP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡，而更多的实验表明TIMP-4为肿瘤生长的抑制因素[2，3]。为进一步开展对TIMP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究，以及对其在其他领域的功能，本实验采用分子生物学的基因克隆、表达和纯化等手段，力求获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白，为以后的研究打下基础。 1 资料和方法 材料 组织来源成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。 菌种、质粒和细胞大肠杆菌TG1、BL21DE3、pBluescriptSK质粒、表达质粒pET-28a均由第二军医大学神经生物学教研室提供。骨肉瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生化研究所。 试剂RNA抽提试剂盒为上海化舜生物工程有限公司产品。RT-PCR试剂盒为Qiagen公司产品。Pyrobest DNA聚合酶为Takara公司产品。限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶为MBI公司产品。质粒抽提和胶回收试剂盒为Viogene公司产品。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶为上海生工公司产品。Ni2-NTA柱为Sigma公司产品。 方法 RT-PCR 总RNA的提取取成熟SD大鼠心肌组织约150 mg，参考萨姆布鲁克等方法及RNA抽提试剂盒手册，电动匀浆后行总RNA的提取。 cDNA的合成参考RT-PCR试剂盒实验手册进行。RNA1μg/μlμl，dNTPs5mM dNTPμl，Oligo-dT引物μl，RNase抑制剂μl，逆转录酶μl，无RNase水加至20μl。37 ℃温育60 min，然后90 ℃温育5 min使逆转录酶失活。-20 ℃保存。 PCR扩增参考GeneBankgi48255910发表的序列及表达载体pET-28a多克隆位点、应用DNAstar软件设计引物，由上海生工公司合成。 上游引物 5‘ TGCGAATTCATGCCTGGGAGCCCT 3‘ EcoRI 下游引物 5‘ GCAAACGTTGATCATCCCTGGTCACTG 3‘ HindIII 取逆转录产物μl为模板，按常规PCR反应条件，先将样品于94 ℃变性5 min，加入 u的Pyrobest DNA聚合酶，按下列参数循环35次94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，最后一个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 载体的构建及DNA序列分析将RT-PCR产物平端与用EcoRⅤ酶切过的pBSK质粒，回收后转化大肠杆菌TG1，挑白斑培养抽提质粒并进行初步酶切鉴定，选择3株酶切合格质粒送生工公司测序。把测序正确的质粒用EcoRI和HindⅢ双酶切，胶回收后与预先经EcoRI和HindⅢ双酶切的表达载体pET-28a在连接