北京大学医学部攻读硕-博士学位研究生课题研究计划书

北京高校医学部 攻读 博 硕 士学位探讨生课题探讨支配书 研 究 生 李玉霞 学 号 1411210743 年 级 2014级 院 （部） 北京高校/香港科技高校医学中心 专 业 医学生物化学与分子生物学 导 师 方征宇 课题探讨起先日期 2015年 03 月 09 日 北京高校探讨生院医学部分院培育办公室制表 说 明 一、 本支配书由探讨生本人在本学科内作过开题报告后填写，一式三份；经院部主管部门批准后一份留教研室，一份留院（部）主管部门，一份送探讨生院医学部分院培育办公室备案。 二、 支配批准后不得随意更改。如有特别状况确需变更者，需填写变更报告，逐级审批。 探讨课题名称 黑色素瘤顺铂获得性耐药相关microRNA筛选及其功能的探讨 探讨课题的目的、理论与实际意义、国内外探讨状况简介 课题的目的 1、构建黑色素瘤顺铂获得性耐药细胞株，与其原始株进行microRNA的高通量筛选比较，找到耐药相关的microRNA，作为潜在的治疗靶点。 2、分析耐药相关microRNA通过调控哪些基因的表达来影响黑色素瘤细胞的耐药性，阐明其分子机制。 理论与实际意义 近几十年来,恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛上升,成为全部恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤,年增长率几乎达到3-5。其中白色人种发病率明显高于其他人种, ,我国和日本等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低,但近年来其发病率呈迅猛上升趋势。恶性黑色素瘤治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗及生物免疫治疗等。化疗在恶性黑色素瘤治疗中仍占有重要地位。目前化疗药物主要有顺铂、长春新碱和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。顺铂是现在临床上多种化疗方案中的主要药物之一,通过与癌细胞的脱氧核糖核酸发生交叉联结,诱导肿瘤细胞的凋亡而起抗癌作用,属细胞增殖周期非特异性药物，但是多种恶性黑色素瘤常会对顺铂产生自然或获得性耐药,因而提高顺铂的抗肿瘤作用,解决顺铂耐药在恶性黑色素瘤的化疗中有着重要的实际意义。 顺铂耐药机制,主要包括细胞内药物积累的削减，DNA损伤修复作用增加,凋亡通路的改变以及一些microRNA的异样表达。由于microRNA的表达易于调控，假如能找到黑色素瘤中与耐药相关的microRNA，可建立以此为靶点的干预手段。 国内外探讨状况简介 在其他肿瘤细胞中，已经有人验证出一些microRNA的改变会影响肿瘤对顺铂的敏感性，而目前关于microRNA在黑色素瘤顺铂获得性耐药机制中的作用探讨较少。 主要探讨内容 探讨内容1构建黑色素瘤顺铂耐药株 选取了七种黑色素瘤细胞系M7、M21 、SK-MEL-103、M29 、A375、M8 、SK-MEL-19依次检测对顺铂的敏感性,在对顺铂比较耐受的细胞株中选取了A375、M8、SK-MEL-19构建了顺铂耐药株并将A375、M8做了microRNA的表达谱芯片。 探讨内容2黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证 通过分析microRNA表达谱芯片，对黑色素瘤顺铂耐药株中异样表达的microRNA用荧光定量PCR进行验证，确定要探讨的microRNA。 探讨内容3 顺铂耐药相关基因反向筛选预料microRNA 查阅文献，汇总顺铂耐药相关基因，在黑色素瘤顺铂耐药株与原始株中用荧光定量PCR验证，依据耐药基因的改变反向预料microRNA。 探讨内容4microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制 依据microRNA靶基因预料数据库找到靶基因，进一步探讨microRNA对顺铂黑色素瘤耐药的影响及其分子机制。 主要探讨方法 1、 构建黑色素瘤顺铂耐药株 MTS法检测药物敏感性以及顺铂耐药株的耐药指数。 2、 黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证 Real-time PCR验证microRNA芯片结果。 3、 顺铂耐药相关基因反向筛选预料microRNA Real-time PCR验证顺铂耐药相关基因，microRNA靶基因预料数据库分析结果。 4、 microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制 Dual-Luciferase Reporter验证microRNA与靶基因的关系，慢病毒构建靶基因相关稳转株，Western Blotting验证靶基因相关蛋白的改变。 探讨进度及详细支配 2015年3月-2015年8月进度黑色素瘤顺铂耐药株构建 2015年9月-2015年12月进度microRNA芯片分析及验证,顺铂耐药相关基因的筛选 2016年1月-2016年10月支配microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制的探讨 预期结果 1、 通过microRNA芯片找到与黑色素瘤顺铂耐药相关的microRNA 2、 通过microRNA靶基因预料数据库找到microRNA的靶基因 3、 microRNA的靶基因通过调整细胞内的相关蛋白对顺铂耐药有作用，通过敲除或者过表达该基因可以逆转黑色素瘤顺铂获得性耐药。 完 成 课 题 的 条 件 帮助导师详细指导的人员配备 周游博士后、细胞培育技术员黎满慧、试剂选购技术员董小林 主要仪器设备状况 Bio-Rad PCR仪、Bio-Rad Rael-time PCR仪、Bio-Rad 酶标仪、Bio-Rad 蛋白电泳仪、 Eppendorf 离心机、Stuart涡旋振荡器、Wise Therm 干浴锅、超净台、显微镜、-20℃冰箱等 试验动物状况 没有动物试验 药物试剂等来源状况 DMEMGIBCO、PBSInvitrogen、TyrisinGIBCO、MTSPromega、Lipofection2000Promega、RT kitPromega、Real-time supermix Promega、BCATransGen Biotech、BSAsigma等。 协作单位及协作内容落实状况 没有 其它 导师审查看法 导师签名 年 月 日 教研室（探讨室）审查看法 主任签名