蛋白质综合项目工程重点

一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）以蛋白质分子构造规律及其生物功能关系作为基本，通过化学、物理和分子生物学手段进行基因修饰或基因合成，对既有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类对生产和生活需求工程技术。 2、构造模体（supersecondary structure，motif）介于蛋白质二级构造和三级构造之间空间构造,指相邻二级构造单元组合在一起，彼此互相作用，排列形成规则、在空间构造上可以辨认二级构造组合体，并充当三级构造构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、构造域（domain）是在二级构造或超二级构造基本上形成三级构造局部折叠区，它是相对独立紧密球状实体。 4、蛋白质折叠protein folding从体内新生多肽链或体外变性多肽链一维线性氨基酸序列转化为具备特性三维构造活性蛋白质过程。 5、分子伴侣 （molecular chaperone）一大类互相之间没关于系蛋白质，它们具备共同功能是协助其她含蛋白质构造在体内进行非共价组装和卸装，但不是这些构造在发挥其正常生物学功能时永久构成某些。 6、晶胞Unit cell空间点阵单位（大小和形状完全相似平行六面体），是晶体构造最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）指核磁矩不为零核，在外磁场作用下，核自旋能级发生塞曼分裂Zeeman splitting，共振吸取某一特定频率射频辐射（radio frequency，RF）物理过程。 8、化学势（位）移 （d）在有机化合物中，各种氢核周边电子云密度不同（构造中不同位置）共振频率有差别，即引起共振吸取峰位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数 （J）由于自旋裂分形成多重峰中相邻2峰间距离。用以表征2核之间耦合伙用大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）一种基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达全套蛋白质。 二、问答题 1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变办法 随机突变UV、X射线、其她化学办法、转座元件、简并引物 定点突变核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖 1）、Kunkel突变法 U U U U U U Template U U U U U U Template U U Mutant Template U U U U dut-ung-双突变菌株添加突变引物 在不含U碱基噬菌体内延伸引物 转染于dutung野生型受体菌 不含U碱基保存，含U碱基被切除 原理当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内dUTP浓度大为增长，并且某些dUTP会掺入到DNA合成中应当由胸腺嘧啶占据位置。而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中尿嘧啶残基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小某些胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F’菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养M13噬菌体DNA中会具有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung菌株，尿嘧啶被除去，并因而产生某些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感位点。病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。 Kunkel 突变法正是运用上述机制，一方面在dut-ung-双突变菌株中培养恰当重组M13噬菌体，制备出带U单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反映混合物转染ung受体菌，模板链因由U碱基位点存在而被破坏，野生型噬菌体产生受到抑制。大某些（＞80）后裔噬菌体是由所转染不带U负链复制而来。由于该链是由突变引物延伸而来，因而，后裔噬菌体多带有突变目的基因。因此，Kunkel 突变法所产生突变体不需要运用标记寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来拟定突变体。 2）、DpnI法进行定点突变 常规大肠杆菌中质粒含DpnⅠ位点 添加一对正反向突变引物 体外退火延伸 模板质粒对DpnⅠ酶敏感，被切除 体外合成突变序列质粒成功转化 原理一对包括突变位点引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，所谓循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终结，再通过重复加热褪火延伸循环，这个反映区别于滚环扩增，不会形成各种串联拷贝。正反向引物延伸产物退火后配对成为带缺刻开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于本来模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰，对DpnI敏感而被切碎（DpnI辨认序列为甲基化GATC，GATC在几乎各种质粒中都会浮现，并且不止一次），而体外合成带突变序列质粒由于没有甲基化而不被切开，因而在随后转化中得以成功转化，即可得到突变质粒克隆。 2、重叠延伸PCR（4个引物）技术 Forward mutagenic primer SP6 primer 3’ Remove primers Denature and anneal First PCR T7 primer Reverse mutagenic primer DNA cloning T7 primer SP6 primer Second PCR Extend to full length by DNA polymerase 3’ （正向引物） （反向引物） （第一轮PCR，共有4种产物） （引物退火变性延伸） （只能5’ 3’方向聚合） （用DNA聚合酶扩增至完整链） （第二轮PCR） （用两端引物扩增目基因） 原理由于采用品有互补末端引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后扩增反映中通过重叠链延伸,将不同来源扩增片段重叠拼接起来.此技术运用PCR技术可以在体外进行有效基因重组,并且不需