3D细胞培养

3D多细胞肿瘤球的培育 原创 2017-04-20 医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培育方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。 与传统的2D贴壁细胞培育模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。 因此，3D多细胞肿瘤球培育模型已经渐渐应用于干细胞培育和分化、癌症探讨、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。 虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培育模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型须要一系列的培育过程和表征手段。 本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采纳倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行具体表征。 1 试验前打算工作 1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培育基（含10FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷； 2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其溶化成液体状态； 3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。 2 琼脂糖包被96孔板 1. 精确量取6 mL RPMI 1640培育基（或DMEM培育基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min； 2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min； 3. 灭菌完成后，快速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。 留意由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后肯定要快速转移至超净台内并快速加入至96孔板中。 此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，须要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。 4. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。 3 配置含Matrigel基质胶细胞悬液 1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI 1640完全培育基（或DMEM完全培育基）将细胞悬液浓度调整至2.0105 cells/mL，备用。 2. 将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将RPMI 1640完全培育基以及解冻的Matrigel基质胶从冰箱内取出置于冰上。 留意由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中肯定要保持低温。 3. 将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。依据计算量（2.5，v/v）用移液器将300 μL Matrigel基质胶加入到12 mL RPMI 1640完全培育基内，快速混匀。 留意由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此运用的移液器枪头也须要预冷。 4. 加入步骤1中的细胞悬液（约600 μL），使细胞浓度为10000 cells/mL，快速混匀，备用； 4 将细胞悬液铺入琼脂糖包被的96孔板 1. 将上述步骤4中配置好的含有Matrigel基质胶的细胞悬液放入加样槽内，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被琼脂糖的96孔板内。 2. 采纳低温离心机进行离心，离心条件为4℃，1000g，10 min。 留意离心96孔板时为保持无菌，将96孔板的四周用封口膜封住。 3.离心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，喷洒酒精后放入培育箱内培育。整个培育流程如图1所示。 4. 在培育的第3、5和7天，更换孔内的100 μL培育基并采纳倒置显微镜视察肿瘤球的形态。 5.若要采纳3D多细胞肿瘤球进行药物试验，在培育7天后，用移液器取出孔内的100 μL培育基，加入100 μL给药溶液，然后置于培育箱内培育并定期采纳倒置显微镜视察肿瘤球的生长状况（图2）。 5 3D多细胞肿瘤球的表征 1. 倒置显微镜视察3D多细胞肿瘤球形态干脆将96孔板置于倒置显微镜下视察即可。 2. 激光共聚焦显微镜视察用移液器当心取出孔内的肿瘤球，用PBS清洗3遍后，采纳4多聚甲醛固定，并用Hoechst 33258对细胞核进行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦显微镜下视察（图3）。 3.环境扫描电镜视察用移液器当心取出孔内的肿瘤球，用PBS清洗3遍后，固定干燥后进行环境扫描电镜视察（图4）。 图4