3.MTT测定细胞增值抑制率

一、 试验原理 MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-4,5-dimethylthiahiazo -z-y1-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-4，5-二甲基噻唑-2-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（azan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波特长测定其光汲取值，在肯定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。依据测得的吸光度值（OD值），来推断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（假如是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 二、 试验打算 1. MTT 的配置 MTT 一般最好现用现配，过滤后 4℃避光保存两周内有效，或配制成 5 mg/ml 保存在 -20℃长期保存，避开反复冻融。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。可把 MTT 粉末称量分装在 EP 管里，用的时候现配。当 MTT 变为灰绿色时就肯定不能再用了。配制 MTT 时用 PBS（pH7.4）溶解， 60℃ 水浴助溶。MTT 加入细胞前还是须要以过滤的方式灭菌为宜 MTT 有致癌性，MTT 对细菌很敏感，配成的 MTT 须要无菌。往 96 孔板加MTT时可以把操作台及四周上的照明灯关掉。 MTT一般是过量的，所以96孔板中 10 uL 足够。培育基超过 100 uL，MTT 依据 10 的比例加入。MTT 与培育基振荡混匀。 2. DMSO 在同一试验中不要更换 DMSO，DMSO 的量可为 100 uL 或 150 uL。 加DMSO前把孔中液体尽量弃干净。否则一是沉淀会很难溶解，二培育液的颜色在检测时也能被测到，会对最终结果造成影响。但前提是不能把细胞结晶沉淀也一起吸掉。加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5-10 min，时间限制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不行信。放入 37℃放孵育箱 15 min 溶解结晶。 三、试验操作 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100 uL 铺板使待测细胞调密度至 1000-10 000 孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。 2. 5 CO2，37℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般 5-7 个梯度。每孔 100 uL，设 3-5 个复孔。建议设 5 个，否则难以反应真实状况。 3. 5 CO2，37℃ 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下视察。 4. 每孔加入 20 uL MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5 MTT），接着培育 4 h。若药物与 MTT 能够反应，可先吸弃去培育液，当心用 PBS 润洗 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培育液。 5. 终止培育，当心吸去孔内培育液。 6. 每孔加入 150 uL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490 nm/ 570nm处测量各孔的吸光值。 7. 同时设置调零孔（培育基、MTT、二甲基亚砜），比照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜）。 四、预试验及留意事项 正式试验前，要进行预试验检测其贴壁率、倍增时间以及接种不同细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培育时间，以保证培育终止致细胞过满。保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少视察不到差异。 1. 药物浓度的设定。肯定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。依据初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 2. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最终得到不同时间点的抑制率改变状况，画出改变的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应当就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 3. 培育时间。200ul的培育液对于10 4～105增殖期细胞来说，很难维持68h，假如养分不够的话，细胞会由增殖期慢慢趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液。 4. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞肯定数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的上升。 5. 试验时应设置调零孔，比照孔，加药孔。调零孔加培育基、MTT、二甲基亚砜。比照孔和加药孔都要加细胞、培育基、MTT、二甲基亚砜，不同的是比照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 6. 避开血清干扰。用含15胎牛血清培育液培育细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光汲取值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培育液进行。在呈色后，尽量吸净培育孔内残余培育液。 7. 接种时最好依据预试验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。假如铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快养分会不够，最终导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采纳10000/ml，100ul/孔。细胞密度要依据不同细胞的特点来定。假如你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，假如你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与比照的区分更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。（对于不同的细胞，每孔细胞数要摸索一下，比照组OD在1.4以下为佳，当然通常来说更不要超过2。 8. 留意细胞悬液肯定要混匀，以避开细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要娴熟，尽量避开人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是假如操作不熟，CV会在8左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要娴熟些、快些上板。