3.MTT测定细胞增值抑制率
一、 试验原理 MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-4,5-dimethylthiahiazo -z-y1-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-4,5-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(azan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波特长测定其光汲取值,在肯定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。依据测得的吸光度值(OD值),来推断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(假如是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。 二、 试验打算 1. MTT 的配置 MTT 一般最好现用现配,过滤后 4℃避光保存两周内有效,或配制成 5 mg/ml 保存在 -20℃长期保存,避开反复冻融。最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。可把 MTT 粉末称量分装在 EP 管里,用的时候现配。当 MTT 变为灰绿色时就肯定不能再用了。配制 MTT 时用 PBS(pH7.4)溶解, 60℃ 水浴助溶。MTT 加入细胞前还是须要以过滤的方式灭菌为宜 MTT 有致癌性,MTT 对细菌很敏感,配成的 MTT 须要无菌。往 96 孔板加MTT时可以把操作台及四周上的照明灯关掉。 MTT一般是过量的,所以96孔板中 10 uL 足够。培育基超过 100 uL,MTT 依据 10 的比例加入。MTT 与培育基振荡混匀。 2. DMSO 在同一试验中不要更换 DMSO,DMSO 的量可为 100 uL 或 150 uL。 加DMSO前把孔中液体尽量弃干净。否则一是沉淀会很难溶解,二培育液的颜色在检测时也能被测到,会对最终结果造成影响。但前提是不能把细胞结晶沉淀也一起吸掉。加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5-10 min,时间限制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不行信。放入 37℃放孵育箱 15 min 溶解结晶。 三、试验操作 1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入 100 uL 铺板使待测细胞调密度至 1000-10 000 孔(边缘孔用无菌 PBS 填充)。 2. 5 CO2,37℃ 孵育,至细胞单层铺满孔底(96 孔平底板),加入浓度梯度的药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般 5-7 个梯度。每孔 100 uL,设 3-5 个复孔。建议设 5 个,否则难以反应真实状况。 3. 5 CO2,37℃ 孵育 16-48 小时,倒置显微镜下视察。 4. 每孔加入 20 uL MTT 溶液(5 mg/ml,即 0.5 MTT),接着培育 4 h。若药物与 MTT 能够反应,可先吸弃去培育液,当心用 PBS 润洗 2-3 遍后,再加入含 MTT 的培育液。 5. 终止培育,当心吸去孔内培育液。 6. 每孔加入 150 uL 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡 10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490 nm/ 570nm处测量各孔的吸光值。 7. 同时设置调零孔(培育基、MTT、二甲基亚砜),比照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜)。 四、预试验及留意事项 正式试验前,要进行预试验检测其贴壁率、倍增时间以及接种不同细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培育时间,以保证培育终止致细胞过满。保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少视察不到差异。 1. 药物浓度的设定。肯定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。依据初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 2. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最终得到不同时间点的抑制率改变状况,画出改变的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应当就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。 3. 培育时间。200ul的培育液对于10 4~105增殖期细胞来说,很难维持68h,假如养分不够的话,细胞会由增殖期慢慢趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液。 4. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞肯定数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的上升。 5. 试验时应设置调零孔,比照孔,加药孔。调零孔加培育基、MTT、二甲基亚砜。比照孔和加药孔都要加细胞、培育基、MTT、二甲基亚砜,不同的是比照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。 6. 避开血清干扰。用含15胎牛血清培育液培育细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光汲取值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10胎牛血清的培育液进行。在呈色后,尽量吸净培育孔内残余培育液。 7. 接种时最好依据预试验摸索出的密度接种,因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。假如铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快养分会不够,最终导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采纳10000/ml,100ul/孔。细胞密度要依据不同细胞的特点来定。假如你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,假如你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与比照的区分更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。(对于不同的细胞,每孔细胞数要摸索一下,比照组OD在1.4以下为佳,当然通常来说更不要超过2。 8. 留意细胞悬液肯定要混匀,以避开细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要娴熟,尽量避开人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是假如操作不熟,CV会在8左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要娴熟些、快些上板。