鸽ⅰ型副黏病毒pl分离株f基因的克隆及其dna疫苗的研究.doc

鸽Ⅰ型副黏病毒 PL 分离株 F 基因的克隆及其 DNA 疫苗的研究 摘要根据 GenBank 报道的鸽 Ⅰ型副黏病毒 F 基因序列设计了一对引物，以鸡 新城疫病毒 PL 分离株基因组为模板，通过 RT-PCR 扩增出了 1.66kb 左右的 F 基因片段，序列分析表明 PL 株 F 基因与国内外 17 株鸽Ⅰ型副黏病毒或鸡新城 疫 F 基因核苷酸序列的同源性为 76.3-98.6。将 PL 株 F 基因插入真核表达载 体 PCDNA3.1V5HIS 中，构建了真核表达质粒 PCDNA3.1-PPMV-1-F，将构建 的真核表达重组质粒免疫 1 月龄非免疫新城疫的乳鸽，剂量为 100μg/羽，2 周 后加强免疫 1 次，并在免疫后 0d、7d、14d、21d、28d 翼下静脉采血分离血清， 用间接 ELISA 分别检测各组血清抗体，ELISA 检测结果表明真核表达质粒免 疫乳鸽后产生的抗体与鸽Ⅰ型副黏病毒 F 蛋白发生特异性反应，在免疫第 7d 开 始有抗体产生，在免疫 14d 抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降，说明 F 蛋白具有很好的免疫原性。以真核表达重组质粒免疫乳鸽第 28 天以 100 倍鸡 胚半数感染剂量EID50的 F 基因同源病毒对所有乳鸽进行攻毒。结果显示 重组 质粒免疫组和鸽新城疫蜂胶灭活苗免疫组的免疫保护率分别为 33.3和 100， 显著高于生理盐水组和 PCDNA3.1V5HIS 空载体组，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活苗 组的免疫保护率也显著高于重组质粒组。表明所构建的 F 基因真核表达质粒可 作为候选基因疫苗诱导乳鸽产生免疫保护反应，但还需其他方法来提高其免疫 效率。 关键词鸽Ⅰ型副黏病毒；F 基因；克隆； 鸽Ⅰ型副黏病毒 Pigeon Paramyxovirus 1,PPMV- Ⅰ 病又称鸽瘟 或鸽新城疫，是一种由禽Ⅰ型副黏病毒Avian Paramyxovirus 1,PMV- Ⅰ引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重 腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一 [1,2] 。有资料 记载，1952年Hanson和Sinha首先在Poultry Science 杂志上报道了鸽的 一种类似鸡新城疫的疾病，此后Ahmed和Sabri 1969，Stewart1971， Hilbrich1972，Vindevogel 等1972 ，Maes 等1974 以及Canic1981 先后有报道 [3,4] 。但是，后来经过血清学及分子水平研究确诊并为大多数学者公认的鸽I型副粘病毒首例报道是1977年发生在伊拉克的鸽 Ⅰ型副黏病毒疫情。不过，当时一些学者认为是由疱疹病毒引起， 他们称之为鸽疱疹性脑脊髓炎病毒，Schrag则认为是A/PMV-3[ 5,6] 。 1981年，苏丹，埃及又爆发疫情，从此疫情很快扩散波及到地中海 国家，随之进入法国和德国 [5] ，随后迅速传播到欧洲、美国、加拿 大等地 [1-3] ，到1985 年已传播到亚洲。在1986年前后，我国的鸽群 中也发现了该病 [7] ，现流行全国各省市 [8,9] 。 鸽Ⅰ型副粘病毒对不同品种、不同年龄的鸽都有感染性，传播 迅速，死亡率高。目前防治鸽Ⅰ型副粘病最有效的方式是注射疫苗， 但针对鸽Ⅰ型副粘病的疫苗市场很少见，主要用鸡新城疫（ND）疫 苗防治鸽Ⅰ型副粘病，虽然PPMV-1与NDV存在较高的交叉反应， 不少学者也认为新城疫疫苗能预防鸽Ⅰ型副粘病毒感染，但在生产 实践中这种免疫效果常不够确实、有效。目前，治疗该病尚无特效 药，许多研究人员都在致力于研究一种有效的疫苗或药物防治此病， 加大鸽Ⅰ型副粘病病毒新型疫苗的研发力度成为鸽新城疫防治的当 务之急。 PPMV-1具有与NDV相似的特性，病毒表面的血凝素和神经氨 酸酶HN 能凝集鸡和某些哺乳动物红细胞，这种凝集作用可被特异 性血清所抑制。病毒的基因组为一条单股负链RNA，长约15kb，包 括6个基因3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,其中F基因所编码的融合蛋白在病 毒对细胞的穿透、溶血及细胞与细胞之间的融合方面起主要作用, 决 定病毒毒力的主要因素 [10] ，可以作为研制亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗的候选基因。 上世纪 80 年代末，国内开始新城疫重组 DNA 基因工程疫苗的 研制，在亚单位疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗方面的研究。核酸疫 苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因DNA 或 RNA 直接导入动物 体细胞内, 并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白, 诱导宿主产生 对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的。与传统 的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗可诱导机 体产生全面的免疫应答，而且具有安全可靠、制备简单、同种异株 交叉保护、可产生持久免疫等优点，核酸疫苗被认为是继灭活疫苗、 减毒活疫苗和亚单位疫苗之后的第三代疫苗。本研究克隆了鸽Ⅰ型 副黏病毒 PL 株 F 基因，构建了真核表达质粒 PCDNA3.1-PPMV-1- F，并对其免疫保护性进行了初步研究。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 毒株、实验动物鸽Ⅰ型副黏病毒 PL 株分离自甘肃省平凉 市崆峒区某鸽场的发病鸽群，有甘肃省畜牧兽医研究所鉴定并保存。 试验乳鸽，购自甘肃平凉某鸽场。 1.1.2 主要试剂PCDNA3.1V5HIS 质粒由中国农业科学院兰州兽医 研究所人兽共患实验室馈赠。E.coil DH5α 感受态细胞购自天根生化 科技有限公司。pMD-18T 载体、DNA Marker DL-000、T4 DNA 连接酶、RNAiso Plus 提取试剂、一步法反转录试剂盒（PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 ） 、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购 TaKaRa 公司。PPMV-ⅠF-ELISA 抗体检测试剂盒，有本实验室制备。 其它试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 PPMV-Ⅰ PL 分离株的克隆与序列分析根据 GenBank 公布的 新城疫 F 基因序列，设计一对引物 P1 和 P2，跨幅为 1.66kb,引物序 列见表 1. 表 1.RT-PCR 扩增所用的引物及其序列 引物 引物序列 P1 ATGGGCTCCAAACCTTCTAC P2 TCATGCTCTTGTAGTGG取出-20℃保存的PPMV- Ⅰ PL 分离株鸡胚尿囊液500μL，按照 TaKaRa公司说明书，从尿囊液中提取RNA ，将沉淀风干的RNA 加入 适量RNAase-free水溶解，-80 ℃保存备用。按照PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒说明书，依次加入21 Step Buffer、P1 、P2、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 、提取的RNA模版 和RNase Free dH2O，轻轻微弹，瞬时离心，混匀后按照下列条件进 行RT-PCR扩增50℃ 30 min、94℃ 2 min ，94℃ 30 sec、55℃ 30sec、72℃ 2 min，30个